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M111.
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Un importante indicazione del meccanismo cinetico può derivare dalla determinazione della v0 misurata in funzione della [S] o dei substrati. Si tralascia qui l'integrazione con lo studio della inibizione da prodotto (che approfondiremo in seguito).
I valori della v0 vengono normalmente rappresentati sotto forma di grafici lineari, ottenuti previa trasformazione della eq iperbolica di velocità.
Il primo grafico che analizzeremo è il c.d. Grafico di Hanes, S/v contro S; questo si ottiene dividendo entrambi i termini dell'eq. di Michaelis per S per poi farne il reciproco,
v/[S] = V/Km+[S] ; [S]/v=Km/V + [S]/V
Quindi il grafico di Woolf, v contro v/[S], ottenuto moltiplicand entrambi i membro della eq per Km+[S];
vKm + v[S] = V[S] e dividendo per S riarrangiando, v= V-Km(v/[S])
tale grafico può esser utilizzato per minimizzare gli effetti di errori nella determinazione della velocità perchè questa è nel grafico in forma non reciproca.
Il grafico di Eadie-Hofstee o Eadie-Scatchard, v/A contro v, si ottiene dividendo l'eq del grafico di Woolf per Km e riarrangiando,
v/[S] = V/Km - v/Km
Ed ora il grafico di Lineweaver-Burk, 1/v contro 1/S;
è questo il grafico più usato in letteratura e nei principali testi. E' ottenuto scrivendo l'eq di Michaelis in forma reciproca e scomponendo,
1/v = (Km+[S])/(V[S])
1/v = 1/V + (Km/V) * (1/[S])
I caratteristici parametri della eq sono l'intercetta sull'asse y, definita intercetta e pari a 1/V, quindi la pendenza, Km/V, definita dal termine "slope" (trad. ing.).
Vi sono due inconvenienti fondamentali, incrementi uguali di [S] producono incrementi diseguali dei reciproci, inoltre, più grave, piccoli errori nella misura della velocità alle basse [S] sono amplificati nel reciproco. Il primo problema è scongiurato dalla scelta di [S] che diano incrementi uguali in forma reciproca; il secondo è ineliminabile e sono consiliate integrazioni anche con le altre linearizzazioni secondo il caso.
Nel caso di ottenimento di dati dispersi si consiglia di ricercare la causa della magra raccolta piuttosto di sprecare energie per la miglior linearizzazione.
E' inoltre necessario dire che oggi la presentazione grafica assume solo un livello qualitativo, la determinazione quantitativa è ottenuta con l'impiego di software dedicati programmati riferendosi all'eq iperbolica.
L'eq. dei doppi reciproci si mantiene inalterata anche in caso di meccanismi a più di un substrato, ora però slope ed intercetta contengono più di due costanti cinetiche ed anche la [S]2, si avrà una famiglia di rette composta dal numero di [S] impiegate; le costanti cinetiche saranno ora ricavate da grafici secondari.
Mi riservo vari approfondimenti in merito nel prossimo avvenire, questo minimalissimo compendio vuol servire per chiarire qualche idea, saluti a tutti.
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Cinetica enzimatica - I grafici lineari |