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GiorgiaB86.
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Ciao, mi sono appena iscritta a biotecnologie e avrei bisogno di qualche dritta per questi quesiti:
1. Voglio produrre in grandi quantità un polipeptide idrofilico, del peso di 25 kDa, che sarà utilizzato come farmaco per la cura di una malattia. Dispongo del cDNA di questo polipeptide.
Descrivere per punti la strategia che si intende adottare per produrre e purificare efficacemente il polipeptide tenendo conto dei possibili problemi a cui si può andare incontro e delle eventuali soluzioni;
2. Mediante l'uso di una sonda omologa ho operato lo screening di una libreria di cDNA alla ricerda del clone codificante una proteina di 60KDa espressa nel fegato di topo che voglio produrre in forma ricombinante. Ho purificato un clone che, opportunamente digerito con enzimi di restrizione, è risultato lungo circa 2100 bp.
Ritiene che questo frammento costituisca il cDNA della proteina che sto cercando? In caso positivo o negativo come pensa di continuare l'analisi?
3. La fibrosi cistica è dovuta alla mutazione del gene (completamente sequenziato) CFTR. La mutazione R1162ter provoca il cambiamento della tripletta CGA (Arginina) nella tripletta UGA (tripletta di stop); questa mutazione causa anche la comparsa di un sito di restrizione per l'enzima DdeI.
Quale procedura può essere usata nella diagnosi prenatale? Su quale principio si basa e come si interpreta il risultato?
4. Devo produrre in grandi quantità una proteina virale glicosilata che si vorrebbe usare per l'immunizzazione dei polli. Ho a disposizione il cDNA della proteina e un anticorpo monoclonale in grado di riconoscerla. Quale sistema di espressione devo usare e perchè? Che strategia adotto per purificare la proteina?
5. Conosco la sequenza del primo esone di un gene, espresso nel rene di topo, del quale vuole clonare il cDNA. Con quello che ho a disposizione riesco a clonare il cDNA? Che strategia adotto per ottenere il cDNA?
Grazie mille!. -
**Stefy83**.
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1- Creo un costrutto PROMOTORE+TAG+ cDNA D'INTERESSE da inserire in un plasmide di Coli.
Esaminiamo ogni elemento del costrutto:
- TAG: è una sequenza di cDNA di una proteina a me nota (ad esempio il GST, una proteina che lega il glutatione). Se metto questa sequenza a monte del cDNA di interesse, quando avverrà la traduzione, si creerà una proteina di fusione composta da a GST+PROTEINA CHE VOGLIO ISOLARE. In questo modo è più facile isolare la proteina di interesse da tutte le altre presenti nel lisato di Coli, dato che è "etichettata" dal GST.
- PROMOTORE: deve essere inducibile, ossia in grado di attivare la trascrizione quando nel terreno di coltura è presente una sostanza specifica. Un esempio è il promotore LAC. In genere in laboratorio, per attivare il promotore LAC si utilizza l'IPTG (Isopropyl-β-D-thio-galactoside ).
Nel momento in cui aggiungo IPTG nel terreno di coli, si attiva la trascrizione del gene/i a valle e di conseguenza la loro traduzione.
Per isolare la proteina di interesse sfrutto la presenza del TAG GST e faccio una cromatografia di affinità: preparo una colonna cromatografica con una resina al glutatione e ci faccio scorrere il lisato di Coli.
Le proteine con il TAG restano legate alla colonna, mentre tutte le altre finiscono nello scarto.
Per staccare le mie proteine dalla colonna le eluisco con una soluzione ad alta concentrazione di glutatione.
Infine con una proteasi specifica stacco il TAG dalla mia proteina di interesse.
I problemi a cui si può andare incontro sono:
-senza un TAG, non "vedo" la mia proteina. La soluzione al problema è il TAG
- La produzione di quantità notevoli di una proteina estrane a a Coli, può essere nociva per la crescita di Coli stessa. Per evitare tutto ciò si usa un promotore inducibile e lo si attiva solo dopo che Coli si è replicata in maniere sufficiente.
- Nel caso la proteina che vuoi esprimere sia eucariote, c'è il problema delle modifiche post-traduzionali. A causa delle differenze tra eucarioti e procarioti, le proteine eucariotiche prodotte dall'espressione di cloni di cDNA in batteri possono essere instabili e avere bassa attività biologica. Per risolvere il problema si ricorre alla trasfezione stabile o transiente in cellule eucariotiche oppure usando vettori virali.
2- Su questa ci dovrei pensare un pò. Magari un biotecnologo potrebbe darti una mano ^^
3 Da un amniocentesi si può estrarre un campione biologico al fine di effettuare un test prenatale.
Dato che questa mutazione crea un sito di restrizione, si può fare un southern blot in seguito a trattamento del campione di DNA del feto con l'enzima DdelI. Nel caso fosse presente l'anomalia, il frammento di DNA sul gel sarebbe più piccolo ( perchè tagliato dall'enzima) e quindi la banda cadrebbe più in basso nel gel rispetto invece a un controllo (frammento intero, non tagliato dall'enzima e quindi più pesante).
4- la glicosilazione è una modifica post-traduzionale che consiste nell'aggiunta di zuccheri alla proteina. Avviene nel Golgi e quindi è tipica degli eucarioti. Per questo motivo bisogna utilizzare un sistema di espressione opportuno. La cosa più semplice è la trasfezione in cellule eucariotiche. Spesso si utilizzano linee cellulari tumorali.
Per purificare la proteina si può utilizzare una cromatografia di affinità con l'Ab monoclonale. L'anticorpo è legato alla resina dellla colonna, in modo tale che quando verso il lisato delle cellule transfettate, le proteine riconosciute dall'anticorpo restano legate, mentre tutte le altre vanno nello scarto. Infine uso una soluzione salina per staccare la proteina di interesse e raccoglierla.
5- Sì. Si può fare un primer extension. Si costruisce un primer dato che conosco la sequenza del primo esone.
Estraggo dalla cellula di rene di topo l'RNA totale e poi purifico solo l'mRNA (sarà l'mRNA di tutti i geni della cellula renale e non solo di quello che mi interessa). Successivamente ibridizzo con il mio primer specifico e, attraverso una trascrittasi inversa e con dei deossinucleotidi trifosfati, utilizzo l'mRNA come stampo per produrre il cDNA.
Comunque è strano che appena iscritta a biotecnologie ci siano già queste domande così tecniche...ma sei al 1 anno???. -
GiorgiaB86.
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Guarda non so davvero come ringraziarti... sono al primo anno di biotecnologie per l'alimentazione e all'esame ci sono domande di questo tipo e io sinceramente non avrei mai saputo da che parte cominciare. Grazie ancora . -
Foster83.
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Riguardo alla 2, ti sequenzi il frammento da 2100 bp ( se non lo conosci già) e poi fa un allineamento per vedere se c'è omologia con la proteina d'interesse. Se è così continui l'analisi, cercando, con la stessa sonda altri cloni, altrimenti ne cerchi un altro. .
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