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dani.f82.
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Ciao a tutti,
sto preparando una idoneità "Tecnologie ricombinanti" ed ho qualche dubbio su genoteche e tecniche di clonaggio.
Vi scrivo come domande i miei dubbi.
Ringrazio tanto in anticipo tutti coloro che mi aiuteranno.
Dani
1. Per il clonaggio di geni responsabili di patologie, ci sono 2 metodiche: il clonaggio fnzionale e quello posizionale.
*CLONAGGIO FUNZIONALE: parto dalla funzione proteica alterata (che conosco) e arrivo a isolare fisicamente il gene e a mapparlo sul genoma, ma non ho capito come si fa ad isolare il gene con questa strategia, e poi la mappatura sul genoma è fisica? Cioè uso il gene come sonda per ibridazione in situ su cromosomi metafasici?
*CLONAGGIO POSIZIONALE: parto dalla mappatura genetica (con l'analisi dei linkage) e arrivo ad isolare una zona del genoma contenente il gene. Per trovare poi il gene preciso, uso la strategia del gene candidato? E come faccio a dire che un gene candidato è quello giusto? E come faccio ad arrivare alla proteina codificata dal gene candidato giusto?
2. Ho chiari tutti i passaggi per costruire una genoteca di cDNA, ma dei frammenti di cDNA nei loro vettori, ne conosco la sequenza? O devo stabilirla a posteriori, cioè dopo aver creato la genoteca? E come lo faccio?
3. Nella marcatura del DNA con Biotina, se abbiamo in soluzione degli eteroduplex nei quali la biotina è solo su un filamento, inseriamo delle sferette magnetiche con la Streptavidina che si legano alla biotina, ma quando vado a ripescare dalla soluzione le sferette, come faccio a differenziare quelle biotinilate da quelle no?
Scusatemi se sono stata un pò prolissa,
ma spero che le mie domande siano state chiare.
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