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dani.f82.
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Ciao a tutti,
sto preparando una idoneità "Tecnologie ricombinanti" ed ho qualche dubbio su genoteche e tecniche di clonaggio.
Vi scrivo come domande i miei dubbi.
Ringrazio tanto in anticipo tutti coloro che mi aiuteranno.
Dani
1. Per il clonaggio di geni responsabili di patologie, ci sono 2 metodiche: il clonaggio fnzionale e quello posizionale.
*CLONAGGIO FUNZIONALE: parto dalla funzione proteica alterata (che conosco) e arrivo a isolare fisicamente il gene e a mapparlo sul genoma, ma non ho capito come si fa ad isolare il gene con questa strategia, e poi la mappatura sul genoma è fisica? Cioè uso il gene come sonda per ibridazione in situ su cromosomi metafasici?
*CLONAGGIO POSIZIONALE: parto dalla mappatura genetica (con l'analisi dei linkage) e arrivo ad isolare una zona del genoma contenente il gene. Per trovare poi il gene preciso, uso la strategia del gene candidato? E come faccio a dire che un gene candidato è quello giusto? E come faccio ad arrivare alla proteina codificata dal gene candidato giusto?
2. Ho chiari tutti i passaggi per costruire una genoteca di cDNA, ma dei frammenti di cDNA nei loro vettori, ne conosco la sequenza? O devo stabilirla a posteriori, cioè dopo aver creato la genoteca? E come lo faccio?
3. Nella marcatura del DNA con Biotina, se abbiamo in soluzione degli eteroduplex nei quali la biotina è solo su un filamento, inseriamo delle sferette magnetiche con la Streptavidina che si legano alla biotina, ma quando vado a ripescare dalla soluzione le sferette, come faccio a differenziare quelle biotinilate da quelle no?
Scusatemi se sono stata un pò prolissa,
ma spero che le mie domande siano state chiare.
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dani.f82.
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...evidentemente le mie domande non sono state chiare...
ma non c'è nessuno che ha studiato queste cose? non ci credo...
Dani. -
dani.f82.
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Ok,
provo a riformulare le mie domande in modo più facile...
*come si fa ad isolare il gene con la strategia del clonaggio funzionale? (non sono sicura, ma è con ibridazione in situ su cromosomi metafasici?)
*dopo aver individuato con l'analisi dei linkage una regione dove so che c'è il gene che sto studiando, come faccio ad individuare il gene giusto?
*con la strategia del gene candidato, come faccio ad essere sicura che il mio candidato sia effettivamente il gene responsabile della patologia che sto studiando?
*nella genoteca di cDNA, conosco la sequenza dei framenti inseriti nei vettori o devo stabilirla a posteriori dopo aver costruito la genoteca?
*come si fa la marcatura con biotina?
Per favore aiutatemi... a tutti.
Dani. -
M111.
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Per quel che mi riguarda ho avuto problemi alla rete e quindi sono stato poco presente.
Ho iniziato da due settimane il corso di biologia molecolare (9 cfu) e deve ancora arrivarmi il testo per il laboratorio, che tratta specificatamente alcuni degli argomenti che proponi, se avrai la pazienza di attendere pochi giorni spero di poterti rispondere con cognizione di causa visto che intendo divorarlo.
Ovviamente invito calorosamente qualcuno a precedermi
Edited by M111 - 2/3/2009, 14:59. -
dani.f82.
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Ciao M111,
ti ringrazio di avermi risposto!
Nel frattempo stamattina ho preso una dispensa della prof che spero mi chiarisca qualche idea, ma aspetto comunque la tua risposta!
Grazie!
Dani. -
M111.
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Non ho ancora preso il libro, per mercoledì dovrei ritirarlo
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dani.f82.
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Ok... grazie!
Dani. -
M111.
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L'ho letto..per altro siamo andati avanti con le spiegazioni e qualcosa abbiamo già affrontato...solo che per risponderti compiutamente dovrei scrivere un po', solo per alcune cose eh....
non so..magari ti dico per MP il titolo e te lo prendi in qualche biblioteca di scienze?. -
ronin1985.
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ciao Dani sono un biotecnologo allora ascoltami se vuoi effettuare un clonaggio di qualunque genere, o che sia di un gene responsabile a patologie o di un gene responsabile di produzione di antibiotici etc.... devi tener presente che la tecnica di clonaggio la effettuiamo per amplificare il nostro gene d'esame per avere una sua produzione. Allora per trovare il gene oggi si utilizzano degli enzimi di restrizione chiamati endonucleasi che tagliano in siti specifici il dna, cioè riescono a riconoscere il dna dalla sua sequenza nucleotidica. Quindi se noi conosciamo la struttura del nostro dna in esame e conosciamo i suoi polimorfismi inseriamo l'enzima adatto e lo separiamo dalla miscela di reazione.Dopo di che si effettua una tecnica di markers per estrarlo,ovvero si immmette all'interno una sequenza complementare in cui è presente un fosforo radioattivo che viene visualizzato quando si lega al nostro dna d'esame. Questa è la procedura poi ci sono diversi approcci della metodica perchè dipende da cosa vuoi ottenere.
ciao e buono studio. -
M111.
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Ecco...per altro è preferibile che parli (scriva) qualcuno che sicuramente ne sa più di me...e che io raggiungerò tra qualche anno, spero....con la specializzazione 
.................forse. -
dani.f82.
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Ciao a tutti,
scusatemi il ritardo!
Grazie mille sia a ronin che a M111 per le vostre risposte!
Ok M111,mandami il titolo del libro in mp che me lo cerco!
Grazie mille!
Dani.
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